FDA注冊號：
3010704506
如何利用離心機(jī)提取乳酸脫氫酶及輔酶
發(fā)布時間：
2021-02-23
概要：
先來了解下概念以及作用，提取過程不易，總要明確提取目的。
乳酸脫氫酶及輔酶概念：
乳酸脫氫酶(LDH或LD)是糖無氧酵解及糖異生的重要酶系之一，可催化丙酮酸與L-乳酸之間的還原與氧化反應(yīng)，也可催化相關(guān)的α-酮酸。LDH廣泛存在于人體組織中，以心、腎、骨骼肌含量最高，肝、脾、胰和肺組織次之。LDH測定方法主要有比色法和連續(xù)監(jiān)測法。
輔酶（coenzyme）是一類可以將化學(xué)基團(tuán)從一個酶轉(zhuǎn)移到另一個酶上的有機(jī)小分子，與酶較為松散地結(jié)合，對于特定酶的活性發(fā)揮是必要的。有許多維他命及其衍生物，如核黃素、硫胺素和葉酸，都屬于輔酶。這些化合物無法由人體合成，必須通過飲食補(bǔ)充。
乳酸脫氫酶及輔酶作用：
乳酸脫氫酶由酶蛋白和輔酶Ⅰ組成，兩者單獨(dú)存在時，無催化活性，必須共同存在組成全酶才起作用。乳酸脫氫酶廣泛存在于各種組織細(xì)胞，在代謝過程中有重要意義，它可逆地催化乳酸脫氫形成丙酮酸或丙酮酸接受氫生成乳酸，反應(yīng)中由輔酶Ⅰ（NAD＋）起傳遞氫的作用。乳酸脫氫酶屬于不需氧脫氫酶，不能直接將氫交給氧，反應(yīng)中生成的還原型輔酶I，可與其他酶蛋白結(jié)合，將氫傳給其他的遞氫體，通過呼吸鏈被徹底氧化。
利用離心機(jī)提取乳酸脫氫酶及輔酶得方法：
本實(shí)驗(yàn)以乳酸為底物。用新鮮的動物肝臟或肌肉組織的粗制提取液，分別制成酶蛋白部分（用白陶土吸附除去輔酶Ⅰ）和輔酶部分（加熱破壞酶蛋白），觀察兩者單獨(dú)作用及共同作用的情況。實(shí)驗(yàn)中為了便于觀察，用甲烯蘭（美蘭）作為受氫體，已知甲烯蘭能從還原型黃酶接受氫而由藍(lán)色變成白色（甲烯白）。所以本實(shí)驗(yàn)中根據(jù)溶液藍(lán)色的消褪情況判斷乳酸脫氫反應(yīng)的發(fā)生。
實(shí)驗(yàn)器材
水浴鍋；離心機(jī)；離心管；試管；研缽；剪刀；鑷子；實(shí)驗(yàn)動物（小鼠、大鼠或兔）。
實(shí)驗(yàn)試劑
1．玻璃砂 充分洗凈。
2．0．1MpH7．4磷酸緩沖液 稱取Na2HPO411．92g，KH2PO42．18g，加水定容至1升。
3．白陶土 用于吸附輔酶Ⅰ。
4．0．5%KCN液 稱取KCN 0．5g，加水溶解成100ml。
5．5%乳酸鈉溶液 稱取乳酸鈉5g，加水溶解成100ml。
6．0．04%甲烯蘭液 稱取甲烯蘭0．04g，加水溶解成100ml。
實(shí)驗(yàn)方法
1．分別制備酶蛋白提取液及輔酶Ⅰ提取液
?。?）除去輔酶Ⅰ的酶蛋白提取液：取新鮮動物肝（或肌肉）組織3g，剪碎放研缽中加玻璃砂約0．5g，白陶土0．5g，加pH 7．4 0．1M磷酸緩沖液8ml，研成細(xì)粥狀。移入離心管中，以2000rpm離心機(jī)離心5min，傾于另一試管中備用。
?。?）輔酶Ⅰ提取液：取蒸餾水10ml于中試管中，加熱煮沸。取新鮮的肝（或肌肉）組織3g，剪碎，放入沸水中，繼續(xù)煮沸10min，為防止水分過多蒸發(fā)可加蓋。稍冷后傾入乳缽中研細(xì)，移入離心管中放入離心機(jī)離心10min，取上清液備用。
2．取試管4只，標(biāo)明管號，按下圖表加樣：
3．充分混勻，向各管徐徐加人液體石蠟5滴（避免與空氣接觸），靜置試管架上或放37℃水浴15～30min，隨時觀察并記錄各管褪色情況，分析結(jié)果。
注意事項(xiàng)：
1．KCN劇毒，注意安全。
2．乳酸脫氫生成的丙酮酸與KCN結(jié)合，防止可逆反應(yīng)發(fā)生。
3．本實(shí)驗(yàn)中生成的甲烯白易被空氣氧化又轉(zhuǎn)變成甲烯蘭，所以在加入液體石蠟后觀察褪色時不宜振蕩。
4. 離心機(jī)選擇合適轉(zhuǎn)數(shù)，使用注意安全。
關(guān)鍵詞：
上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司
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